USPTO Patents Application 10687850

(12) NACH DEM VERTRAG t)BER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM CEBIET DES
PATENTWESENS (PCT) VERdFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG

(19) Weltorganisation fur geistiges Eigentum
Internationales Buro

(43) Internationales Veroffentlichungsdatum
22. Februar 2001 (22.02.2001)

PCT

(10) Internationale VerofTentlichungsnummer

WO 01/13115 A2

(51) Internationale Patentklassifikation 7 :
C12Q 1/68

(21) Internationales Aktenzeichen:

G01N 33/543,

PCT/DEOO/02758

(22) Internationales Anmeldedatum:

12. August 2000 (12.08.2000)

(25) Einretchungssprache:

(26) Veroffentlichungssprache:

Deutsch
Deutsch

(30) Angaben zur Priori tat:

199 38 138.0 16. August 1999(16.08.1999) DE

(71) Anm elder (fur alle Bestimmungsstaaten mit Ausnahme
von US): NOVEMBER AKTIENGESELLSCHAFT
GESELLSCHAFT FOR MOLEKULARE MEDIZIN
[DE/DE]; Ulrich-Schalk-Strasse 3a, D-91056 Erlangen
(DE).

(72) Erfinder; und

(75) Erfinder/Anmelder (nur fur US): BERTLING, Wolf
[DE/DE]; Meisenweg 22, D-91056 Erlangen (DE). HAS-
SMANN, Jorg [DE/DE]; Hofmannstrassc 118a, D-91052
Erlangen (DE). KOSAK, Hans [DE/DE]; Von-Wit-
zleben-Strasse 23, D-53123 Bonn (DE).

(74) Anwalt: GASSNER, Wolfgang; Nagelsbachstr.
.91052 Erlangen (DE).

49A,

(81) Bestimmungsstaaten (national): AE, AG, AL, AM, AT,
AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR. CU,
CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, Fl, GB, GD, GE, GH, GM,
HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG. KP. KR, KZ, LC, LK,
LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX,
MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL,
TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW.

(84) Bestimmungsstaaten (regional): ARIPO-Patent (GH,
GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), eura-
sisches Patent (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM),
europaisches Patent (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI,
FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OAPI-Patent
(BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE,
SN,TD,TG).

Veroffentlicht:

— ( Ohne internationalen Recherche nbericht und erneut zu
verdffentlichen nach Erhalt des Berichts.

Zur Erkldrung der Zweibuchstaben-Codes, und der anderen
Abkurzungen wird auf die Erkldrungen ("Guidance Notes on
Codes and Abbreviations") am Anfangjeder reguldren Ausgabe
der PCT-Gazette verwieseru

= (54) Title: METHOD AND DEVICE FOR IDENTIFYING A BIOPOLYMER SEQUENCE ON A SOLID SURFACE

(54) Bezeichnung: VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR IDENTIFICATION EINER BIOPOLYMERSEQUENZ AUF
FESTKORPEROBERFLACHEN

^< (57) Abstract: The invention relates to a method for identifying a biopolymer spread on a first surface of a solid substrate, whereby
^ the first biopolymer is brought into contact with a second biopolymer which spread on a second surface, whereby said second
If) biopolymer has an affinity for the first biopolymer; Biopolymer in Kontakt gebracht wird und wobci die Identification des ersten

Biopolymers vorgenommen wird durch Auswertung der durch afOnitatsbedingte Adhesion ausgelfisten Anderung der Impedanz,
^ der Leitfahigkeit im Gleichstrom- und/oder Wechselstrombereich in Abhangigkeit von ciner aufgcpragten Wechsclspannungs- oder

Wechselstrorafrequenz.

^ (57) Zusammenfassung: Die Erflndung betrifft ein Verfahren zur Identifikation eines auf einer ersten Oberflache eines Festkdr-
pcrsubstrats aufgebrachten ersten Biopolymers, wobei das erste Biopolymer mit einem dazu affinen, zweiten sich auf einer zweiten

Q Oberflache befindenden Biopolymer in Kontakt gebracht wird und wobei die Identifikation des ersten Biopolymers vorgenommen
wird durch Auswertung der durch affiniUUsbedingte Adhasion ausgelostcn Anderung der Impedanz oder der Leitfahigkeit im Gleich-

^ strom- und/oder Wechselsu-ombereich in Abhangigkeit von einer aufgepragten Wechselspannungs- oder Wechselstromfrequenz.

WO 01/13115

PCT/DEOO/02758

1-

Verfahren und Vorrichtung zur Identif ikation einer Biopoly-
merseguenz auf Festkorperoberf lachen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
5 Identif ikation einer spezifischen Biopolymersequenz, die auf
einer Festkorperoberf lache gebunden ist.

Aus der US^ 5,780,234 ist es bekannt, den Zustand der Hybridi-
sierung durch Anderung der elektrischen Leitf ahigkeit nachzu-

10 weisen. Dazu ist es nach der Lehre der US 5,780,234 erforder-
lich, daft ein Transfer von freien Elektronen stattfindet. Zu
diesem Zweck sind die Nukleinsauresequenzen mit Elektronendo-
natoren bzw. -akzeptoren kombiniert. Bei einer Hybridisierung
kann es zum. Ladungs transport kommen. Die Anlagerung des nach-

15 zuweisenden Oligonukleotids erfolgt hier aus der Losung.

Weitere Verfahren zur Identif ikation einer Polymersequenz
sind bekannt aus der WO 99/29898, US 5,065,798, WO 98/48275,
US 5,866,336 sowie WO 99/11813.

20

Aus H.W. Fink, C. Schonenberger , Nature 398, 407 (1999) ist
bekannt, da£ die Leitf ahigkeit einzelner DNA-Doppel strange in
der Groftenordnung guter Halbleiter oder leitfahiger Polymere
liegt.

25

S.O. Kelley, N.M. Jackson, M.G. Hill, J.K. Barton, Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 38, 941 (1999) offenbaren, daS Monolagen
von DNA-Doppelstrangen auf Elektrodenoberf lachen eine hohe
Leitfahigkeit und einen schnelleren Ladungs transfer auch liber
30 groSe Abstande aufweisen.

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Techndlogie bereitzu-
stellen, mit der an eine feste Oberflache fixierte Biopolyme-
re eindeutig, schnell und sensitiv identif iziert werden kon-
nen.

5

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Anspriiche 1 und 7
gelost. ZweckmaSige Ausgestaltungen ergeben sich aus den
•Merkmalen der Anspriiche 2 bis 6 und 8 bis 12 .

Nach Mafigabe der Erfindung ist ein Ver'fahren zur Identifika-
tion eines auf einer ersten Oberflache eines ersten Substrats
aufgebrachten ersten Biopolymers vorgesehen, wobei das erste
Biopolymer mit einem dazu af finen, zweiten sich auf einer
Oberflache eines zweiten Substrats befindenden Biopolymer in
■Kontak"t~gebracht" wird "und wobei"d'i"e~Identi f ika'tron -des— ersfen
Biopolymers vorgenommen wird durch Auswertung der durch affi-
nitatsbedingte. Adhasion bewirkten Anderung der Impedanz oder
der Leitf ahigkeit .

20 Unter einem Biopolymer wird insbesondere ein aus Nukleotiden
oder Aminosauren gebildetes Polymer verstanden, z.B. DNA,
RNA, PNA, PTO, Peptid, Protein u. dgl.. Unter einem affinen
Biopolymer wird ein Biopolymer verstanden, das mit einem kor-
re'spondierenden Biopolymer eine Bindung eingehen kann. Die

25 Bindung kann eine kovalerite/ ionische oder auf Wasserstoff-

brucken beruhende Bindung sein. Auch eine durch sterische Ef-
fekte hervorgeruf ene Bindung kommt in Betracht.

. *•'**

Durch die elektronische Detektion der z.B. bei der Hybrid!-
30 sierung auftretenden Leitf ahigkeitsanderung zwischen zwei

Oberflachen wird die Sensitivitat und Spezifitat erhoht sowie
apparativer Auf wand herabgesetzt .

10

T5

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

3

Mogliche Einsatzf elder des erf indungsgema£en Verfahrens lie-
gen in der medizinischen Diagnostic, Identifications-, Co-
^ dierungs- und Erkennungs technik .

5 Als Anderung kann die Anderung der Impedanz oder der Leitfa-
higkeit im Gleichstrom- und/oder Wechselstrombereich in Ab-
hangigkeit von einer aufgepragten Wechselspannungs- oder
Stromf requenz gemessen werden. Dabei kann eine der Oberfla-
chen elektrisch leitfahig sein und die Anderung iiber diese

10 Oberflache gemessen werden. Die Oberflachen konnen aber auch
durch einen Isolator getrennt werden. Dabei kann das erste
und/oder zweite Biopolymer als Schicht auf die Oberflache
aufgebracht sein, wobei darin elektroaktive Metal la tome, -
ionen, -cluster oder Komplexmolekule eingebracht werden. Nach

15 einer weiteren Ausgestaltung ist vorgesehen, da& die Bestim-
mung der Anderung mittels einer Ref erenzelektrode und/oder
einer Gegenelektrode durchgefuhrt wird.

Nach weiterer MaSgabe der Erfindung ist eine Vorrichtung zur
20 Durchfuhrung des erf indungsgema£en Verfahrens vorgesehen, wo-
bei auf einer Oberflache eines ersten Substrats ein erstes
Biopolymer derart aufgebracht ist, da£ es mit einem dazu af~
finen, zweiten auf einer Oberflache eines zweiten Substrats
auf gebrachten Biopolymer in Kontakt bringbar ist, und wobei
.25 zur Identif ikation des ersten Biopolymers eine Einrichtung

zur Auswertung einer durch af f initatsbedingte Adhasion ausge-
los'ten Anderung der Impedanz oder der Leit f ahigkeit vorgese-
hen ist.

30 Ausgestaltungen der Erfindung werden im folgenden erlautert.
Die erf indungsgemaSe Identif ikation der Biopolymere auf einer

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

4

Festkorperoberf lache erfolgt vorteilhaf terweise . nach folgen-
der Vorgehensweise:

Die auf der Oberflache des ersten Substrats fixierten ersten
5 Biopolymere werden mit dazu affinen zweiten Biopolymeren in
Kontakt gebracht. Das hat eine Hybridisierung zur Folge. Die
zweiten Biopolymere konnen auf einer Oberflache eines zweiten
Substrats fixiert sein und z.B. durch Auf einanderpressen mit
den zu identif izierenden ersten Biopolymeren in Kontakt ge-
10 bracht werden. Als Substratwerkstof f kommt Glas, Kunststoff
oder Metall in Betracht. Letztere konnen in Form einer Folie
ausgebildet sein.

Wenn die Hybridisierung zwischen zwei parallelen Oberf lachen
15 erfolgt, kann die Anderung in der Leitf ahigkeit zwischen den
beiden Oberflachen zur Detektion verwendet werden. Dies gilt
in beiden Ausgestaltungsf ormen sowohl fur Gleich- als auch
Wechselstromleitf ahigkeit sphanomene . Zur Erhohung der Leitf a-
higkeit konnen in den aus den Biopolymeren gebildeten Dunn-
20 filmen auch Metallatome, -ionen, -cluster oder Komplexmoleku-
. le eingelagert werden. Alternativ kann die Detektion auch
iiber Fluoreszenz oder andere optische Methoden erfolgen.
Leitfahige Cluster konnen dabei zur Verstarkung optischer Si-
gnale eingesetzt werden.

25

In einer Ausgestaltungsf orm werden als zu identif izierende
erste Biopolymere Nukleinsauren einer bestimmten Sequenz ko-
valent an eine leitfahige Oberflache des ersten Substrats ge-
bunden. Dazu komplementare Nukleinsauren sind an ein zweites
30 leitfahiges Substrat gebunden, das mit dem ersten durch Auf-
einanderpressen in Kontakt gebracht wird. Bei einer Hybridi-
sierung der Nukleinsauren verringert sich der elektrische Wi-

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

5 • •

derstand. Das kann durch konventionelle elektronische Metho-
den nachgewiesen werden.

Esist auch moglich, die mit der Hybridisierung einhergehen-
5 den Anderungen der Kapazitaten in der hybridisierenden

Schicht Wechselstromwiderstande zu detektieren. Weiterhin. ist
auch der Einsatz elektrochemischer Signale, wie z.B. spezifi-
scher Reduktions- und Oxidationspeaks, zur Identif ikation der
Hybridisierung einsetzbar.

10

Die elektronischen Me£gr6£en konnen verstarkt werden, indem
in die Schicht der zu detektierenden Biopolymere Metallatome,.
-cluster oder -ionen eingebracht werden. Das kann sowohl vor
als auch nach der Hybridisierung, z.B. durch Bedampfen oder
15 elektrochemische Methoden, erfolgen. Weiterhin ist auch der
Einsatz von komplexen Molekulen moglich, die sich z.B. bei
Nukleinsauren spezifisch an einzelstrangige Strukturen oder
auch als Interkalatoren an doppelstrangige Konf ormationen an-
lagern und elektroaktive Zentren aufweisen.

20

Das erf indungsgemafee Verfahren kann z.B. im Bereich der Si-
cherheitstechnik zur f alschungssicheren Markierung und Iden-
tif izierung von Banknoten, Chipkarten, Ausweisen u.a.. verwen-
det werden. Im Falle der Identif izierung unter Verwendung ei-
25 ner fliissigen Phase kann das Verfahren auch zur Markierung

und Identif izierung z.B. von Lebensmitteln, Medikamenten o.a.
eingesetzt werden.

Beispiel : -

30 Oligonukleotide einer Lange von 21 Basen werden am 5 % -Ende
kovalent an die Oberflache eines leitfahigen Polykarbo-
nat/Kohlef aser-Kunststof f es f ixiert .

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

6

Die an der Oberflache befindlichen Oligonukleotide werden mit
an einer zweiten Oberf lMche befindlichen komplementaren Son-
den hybridisiert . Das geschieht durch Inkontaktbringen der
beiden Oberf lachen. Wird zwischen der leitfahigen Kunststoff-
5 oberflache und der zweiten Oberflache eine Wechselspannung
einer Frequenz von 250 Hz angelegt und der kapazitive Anteil
des Wechselstromes gemessen, so ergibt sich bei Hybridisie-
rung ein Abfall der Wechselstromleitf ahigkeit um mehr als
10%. Damit kann die Hybridisierung des Oligonukleotids nach-
10 gewiesen werden. Kontrollversuche mit nicht spezifischen Oli-
gonukleotiden ergeben keine wesentliche Leitf ahigkeitsande-
rung.

1

WO 01/13115

PCT/DEOO/02758

7

Patentanspruche

1. Verfahren zur Identif ikation eines auf einer Oberflache
eines ersten Substrats auf gebrachten ersten Biopolymers,

wobei das erste Biopolymer mit einem dazu affinen, zweiten
sich auf einer Oberflache eines zweiten Substrats befindenden
Biopolymer in Kontakt gebracht wird und

10 wobei die Identif ikation des ersten Biopolymers vorgenommen
wird durch Auswertung der durch die af f initatsbedingten Adha-
sion bewirkten Anderung der Impedanz oder der Leitfahigkei t .

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anderung der Impe-
15 danz oder der Leitf ahigkeit im Gleich- und/oder Wechselstrom-

bereich in Abhangigkeit von einer aufgepragten Wechselspan-
nungs- oder Wechselstromf requenz gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eine
2 0 der Oberflacheri elektrisch leitfahig ist und die Anderung

liber diese Oberflache gemessen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Oberflachen durch
einen Isolator getrennten werden.

25

5. Verfahren nach den vorhergehenden Anspriiche, wobei das
erste und/oder zweite Biopolymer als Schicht auf die Oberfla-
che auf gebracht wird, wobei darin elektroaktive Metallatome,
-ionen, -cluster oder Komplexmolekule eingebracht werden.

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

8

6. Verfahren nach den vorhergehenden Anspriiche, wobei die
Bestimmung der Anderung mittels einer Ref erenzelektrode
und/oder einer Gegenelektrode durchgefiihrt wird.

7 . Vorrichtung zur Durchf iihrung des Verf ahrens nach einem
der vorhergehenden Anspriiche, wobei auf einer Oberflache ei-
nes ersten Substrats ein erstes Biopolymer derart aufgebracht
ist, da£ es mit einem da zu affinen, zweiten auf einer Ober-
flache eines zweiten Substrats auf gebrachten Biopolymer in
Kontakt bringbar ist, und wobei zur Identif ikation des ersten
Biopolymers eine Einrichtung zur Auswertung einer durch affi-
nitatsbedingte Adhasion ausgelosten Anderung der Impedanz
oder der Leitf ahigkeit vorgesehen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei mittels der Einrich-
tung zur Auswertung die Anderung . im Gleichstrom- und/oder
Wechselstrombereich in Abhangigkeit von einer aufgepragten
Wechselspannungs- oder Wechselstromf reguenz meSbar ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei mindestens ei-
ne der Oberflachen elektrisch leitfahig ist und die Anderung
uber diese Oberflache meEbar ist.

10. Vorrichtung nach einem der Anspriiche 7 bis 9, wobei des
erste und/oder zweite Bioploymer auf einem auf der Oberflache
vorgesehenen Isolator aufgebracht ist.

11. Vorrichtung nach einem der Anspriiche 7 bis 10, wobei das
erste und/oder zweite Biopolymer in Form einer Schicht auf
die Oberfache ist/sind und die Schicht mit elektroaktiven Me-
tallatomen, -ionen, -cluster oder Komplexmolekulen versehen
ist.

WO 01/13115

PCT/DE00/02758

9

12. Vorrichtung nach einem der Anspruche 7 bis 11, wobei ei-
ne Ref erenzelektrode \ind/oder eine Gegenelektrode vorgesehen
ist/sind.